Apoptose og nekrose i de sirkumventrikulære organene etter eksperimentell subaraknoidal blødning som påvist med annexin V og caspase 3 immunfarging
Mål: De sirkumventrikulære organene (CVOs)
sterk> er avgjørende for de fleste autonome og endokrine funksjoner. Traumer og blødninger kan påvirke funksjonen deres. Målet med denne studien var å undersøke apoptose og nekrose i CVO i den tidlige perioden etter eksperimentell subaraknoidalblødning (SAH) hos rotter, ved bruk av annexin V-affinitet og caspase 3-immunfarging.Metoder: Tre eksperimentelle grupper ble brukt: Dag 1 og 2 etter SAH, og en kontrollgruppe, syv Wistar albinorotter hver. Subaraknoidalblødning ble oppnådd ved transklival basilararteriepunktur. Rotter ble perfusert med 0,9 % NaCl og 0,1 M fosfatbuffer pH 7,4 inntil hjertestans. Apoptose og nekrose i CVO ble målt ved flowcytometri med annexin V-farging, og ved caspase 3 immunfarging.
Resultater: Apoptose i organum vasculosum lamina terminalis (OVLT) , median eminens (ME), og area postrema (AP) var signifikant høyere i dag 1-gruppen enn i kontrollgruppen. Apoptose i det subfornisielle organet (SFO), OVLT, ME og AP var signifikant høyere i dag 2-gruppen enn i kontrollgruppen. Det var signifikante forskjeller mellom dag 1 og dag 2 gruppene, bortsett fra AP. Nekrose i SFO og OVLTvar signifikant høyere i dag 2-gruppen enn i dag 1 eller kontrollgruppene, mens nekrose i ME og AP ikke skilte seg mellom de tre gruppene . Caspase 3-positiv celletetthet var mer intens i dag 2-gruppen enn i dag 1 og kontrollgruppene.
Diskusjon: Forebygging av apoptose kan potensielt forbedre svekkede funksjoner til CVO etter SAH.
Innledning
Apoptose er programmert celledød, som endres ved patologiske tilstander som subaraknoidal blødning (SAH) .1 Apoptose antas å være en medvirkende faktor til patogenesen av tidlig hjerneskade,2 vasospasme,3 og hjerneinfarktene4 sett etter SAH. I litteraturen er det rapporter om apoptose1,2,5,6 og nekrose7,8 etter SAH, og forbedringer i disse etter administrering av apoptosehemmere.5,6 Studier har vist d at hemming av apoptotiske veier etter SAH ikke bare reduserte cellulær død
men også resulterte i en betydelig forbedring i funksjonelt resultat,2,4 og dermed kan ha undertrykt mange av de sekundære skadene forbundet med SAH.1
Foruten mange verdifulle sentre i hjernen, en rekke sensoriske sirkumventrikulære organer (CVO), for eksempel det subforniciale organet (SFO) , organum vasculosum lamina terminalis (OVLT), area postrema (AP) og median eminens (ME, en sekretorisk CVO), påvirkes av SAH. strong>9,10 Sirkumventrikulære organer er rike på nevrotransmittere og er blottet for en blod-hjerne-barriere.11,12
Annexin V har vist seg å samhandle sterkt og spesifikt med fosfatidylserin, og kan dermed brukes til å oppdage tidlig apoptose.15 Caspase 3-immunfarging er en annen metode som for tiden brukes for å oppdage apoptose i vevsprøver.16
I denne studien undersøkte vi tilstedeværelsen av tidlig og sen apoptose/nekrose ved anneksin V-affinitet og caspase 3-immunfarging i CVO-er etter eksperimentell SAH hos rotter. I vår gjennomgang av litteraturen klarte vi ikke å finne noen tidligere rapport som omhandlet dette emnet.
Materialer og metoder
Studieprotokollen ble godkjent av Bu ¨lent Ecevit University Animal Ethics Committee.
Eksperimentene ble utført ved Experimental Surgery, Research and Animal Laboratory ved Bu¨lent Ecevit University, Det medisinske fakultet, Zonguldak, Tyrkia. Totalt ble 21 voksne Wistar-albinorotter, som veide 200–300 g, inkludert i studien. Alle rottene ble holdt ved 22–25uC med passende fuktighet, i en 12/12 timers lys/mørke-syklus, og fikk væske og mat ad libitum. Rottene ble delt inn i tre grupper som følger: Dag 1 etter SAH (n 5 7), Dag 2 etter SAH (n 5 7) og kontrollene (n 5 7). >
Rotter ble bedøvet ved intraperitoneal injeksjon av ketamin (60 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg). Eksperimentell SAH ble utført med en teknikk lik den som er beskrevet av Barry et al.,17 som har blitt beskrevet tidligere.9,10
Kort, et midtlinje cervikalt snitt ble gjort i ryggleie, under en operasjon mikroskop (Takagi OM-5, Japan), og clivus ble eksponert ved bruk av den fremre parafaryngeale tilnærmingen. En benkete vind w foran basilararterien ble opprettet ved hjelp av nåler med stor boring, og tok ekstremt hensyn til ikke å åpne den prepontinske sisternen. En suturnål med en ytre diameter på 75 mm (Ethicon, Livingston, UK) ble satt inn i basilararterien. Tilbaketrekking av nålen forårsaket omfattende blødninger i subaraknoidalrommet, med en jevn fordeling opp til luktområdet. Rottene ble holdt i live i 1 og 2 dager etter SAH under passende forhold.
Rotter ble avlivet ved perfusjon. Under anestesi ble det utført torakotomi, deretter ble venstre ventrikkel kanylert, den nedadgående aorta klemt fast, høyre atrium skåret inn og blodet vasket fra hodet og livmorhalsen med 0,9 % NaCl og 0,1 M fosfatbuffer (pH 7,4) til hjertet stoppet. Dyrene ble halshugget, og prøver av SFO, OVLT, ME og AP ble oppnådd ved bruk av et stereotaktisk rotteatlas (Paxinos & Watson).
Prinsippet for annexin V-metoden er å måle ved hjelp av flowcytometri affiniteten til anneksin V til fosfatidylserin, som translokeres fra den indre plasmamembranen til den ytre brosjyren under
apoptose.15 Celler ble høstet fra de forskjellige CVO
. sterke >s separat. Vi brukte 100 ml cellesuspensjon for hver prøve. Annexin V konjugert med fluorescein-isotiocyanat (FITC)-fargede apoptotiske celler i nærvær av propidiumjodid (PI). Denne reaksjonen muliggjør påvisning av fosfatidylserin på overflaten av apoptotiske celler. Både PI-positive og anneksin V-positive celler indikerte prosentvis nekrotisk status. Vi brukte et kommersielt anneksin-FITC-sett (Beckman-Coulter, Fullerton, CA, USA) i samsvar med produsentens instruksjoner, og en Coulter FC500 > flowcytometer (Beckman-Coulter). En skjematisk presentasjon av tapet av membranlipidasymmetri under tidlig apoptose og anneksin V-spesifikk binding til fosfatidylserin er vist i fig. 1. PI-positive og anneksin V-positive celler indikerer sen apoptose eller nekrose (fig. 1).For histopatologisk og immunhistokjemisk analyse, CVO Innhentet fra rottehjernene ble brukt for alle grupper. Prøver av sirkumventrikulære organer fra hver rotte ble fiksert i 10 % nøytral formalinløsning, og deretter innleiret i parafinvoks. Snitt ble kuttet på en kryostat ved 5–6 mm tykkelse Vevsseksjoner ble deretter avvokset og farget med hematoksylin og eosin (H&E) og kresylfiolett for histomorfologisk analyse. Sirkumventrikulære organer ble evaluert under lysmikroskopi av en enkelt patolog(FB)blindet for studiegruppene. Immunhistokjemisk analyse ved bruk av det polyklonale antistoffet anticaspase 3 (CPP32) (Neomarkers, Cat #RB-1197R7, Fremont, CA, USA) ble også utført for å evaluere apoptose. Immunfarging var basert på streptavidinbiotinperoksidasekompleksteknikken med mikrobølgeantigeninnhenting ved bruk av formalinfiksert parafinvoksinnstøpt vev. Voksinnstøpte seksjoner ble samlet på objektglass og ble deretter avvokset og rehydrert. Etter avvoksing ble seksjoner behandlet med 10 % hydrogenperoksidase i filtrert vann for å blokkere endogen peroksidaseaktivitet. For antigeninnhenting ble objektglass kokt med 10 mmol/L sitratbuffer (pH 7) i 10 minutter i en mikrobølgeovn. Objektglassene ble deretter inkubert med primære antisera, inkludert caspase 3 kanin polyklonalt antistoff (Neomarkers, Cat #RB1197-R7, Fremont, CA, USA). Etter vasking i fosfatbufret saltvann ble vevet på objektglassene inkubert med et biotinkonjugert sekundært antistoff, etterfulgt av inkubering i streptavidinbiotinsystemkomponentene i 30 minutter ved romtemperatur. Reaksjonene ble synlige etter nedsenking av prøvene i 3,39-diaminobenzidintetrahydroklorid (DAB; Lab Vision, Fremont, CA, USA). Etterpå ble seksjonene motfarget med hematoxylin, deretter skylt og montert. Den negative kontrollen hadde det primære antistoffet utelatt, og mandelvev ble brukt som positiv kontroll. Caspase 3-immunreaktivitet ble observert hovedsakelig i cytoplasmaet med noe kjernefarging. Lysbildene ble evaluert på en blind måte av en enkelt patolog (FB). Apoptose, målt ved kaspase 3-positiv celletetthet, ble evaluert i CVO-ene for hver gruppe.
Statistisk analyse
Statistical Package for Social Sciences (versjon 19.0; SPSS Inc, Chicago, IL, USA) ble brukt for alle dataanalyser. Resultatene ble uttrykt som median og rekkevidde. Shapiro–Wilk-testen ble brukt til normalitetstesting for variabler uten normalfordeling, og Kruskal–Wallis-testen ble brukt for sammenligninger mellom de tre gruppene. Conover-testen var brukes til post hoc sammenligninger. For alle statistiske sammenligninger ble 0,05 vurdert statistisk.
Resultater
Flow-cytometriske funn er oppsummert i tabell 1. Grafikk hentet fra PI/annexin signifikant V flowcytometrianalyse av SFO, OVLT, ME og AP (kontroll- og dag 2-gruppene) er gitt i fig. 2. I dag 1-gruppen var resultatene for tidlig apoptose, vist som median (område), som følger: OVLT 0,50 % (0,08–1,89), ME 0,55 % (0,21–0,84) og AP 0,46 % (0,20–1,86), apoptose iSFO skilte seg ikke signifikant fra kontrollgruppen. For dag 2-gruppen var tidlig apoptose som følger: SFO 1,88 % (0,97–2,99), OVLT 1,85 % (0,77–3,16), ME 0,79 % (0,54–1,43) og AP 0,82 % (0,19–1,49). ). ), som var signifikant høyere i alle fire områdene enn i kontrollgruppen. I kontrollgruppen var tidlig apoptose0,12 % (0,02–0,35) i SFO, 0,15 % (0,04–0,71)i OVLT, 0,18 % (0,09–0,34) > i ME, og 0,06 % (0,01–0,24) i AP.
Nekrose i SFO og OVLT i dag 2-gruppen var signifikant høyere enn både i dag 1 og kontrollgruppene, og resultatene for ME og AP skilte seg ikke mellom dag 1 og kontrollgruppene
Histopatologisk undersøkelse av SFO, OVLT, ME, og AP-seksjonene viste mer fremtredende celletap i dag 2-gruppen enn i de andre gruppene.
Caspase 3-positiv celletetthet var mer intens i dag 2-gruppen enn i de to andre gruppene. Det var få kaspase 3-positive celler i kontrollgruppen, og dag 1-gruppen hadde færre kaspase 3-positive celler enn dag 2-gruppen.
Diskusjon
Apoptose er en av mekanismene i utviklingen av celledød, som kan sees etter klinisk og eksperimentell SAH.
I denne studien av CVOer etter eksperimentell SAH, hos rotter, ble apoptose sett i SFO, OVLT, AP, og ME. I dag 1 studiegruppen fant vi økt anneksin V-affinitet til fosfatidylserin (tidlig apoptose)i alle CVO bortsett fra SFO. I dag 2 g
Les: 0
